KROMATOGRAFI KOLOM

Kromatografi adalah proses pemisahan yang tergantung pada perbedaan distribusi campuran komponen antara fase gerak dan fase diam. Fase diam dapat berupa pembentukan kolom dimana fase gerak dibiarkan untuk mengalir (kromatografi kolom) atau berupa pembentukan lapis tipis dimana fase gerak dibiarkan untuk naik berdasarkan kapilaritas (kromatografi lapis tipis). Perlu diperhatikan bahwa senyawa yang berbeda memiliki koefisien partisi yang berbeda antara fase gerak dan diam. Senyawa yang berinteraksi lemah dengan fase diam akan bergerak lebih cepat melalui sistem kromatografi. Senyawa dengan interaksi yang kuat dengan fase diam akan bergerak sangat lambat.

Pemisahan komponen campuran melalui kromatografi adsorpsi tergantung pada kesetimbangan adsorpsi-desorpsi antara senyawa yang teradsorb pada permukaan dari fase diam padatan dan pelarut dalam fase cair. Tingkat adsorpsi xxi

komponen tergantung pada polaritas molekul, aktivitas adsorben, dan polaritas fase gerak cair. Umumnya, senyawa dengan gugus fungsional lebih polar akan teradsorb lebih kuat pada permukaan fase padatan. Aktivitas adsorben tergantung komposisi kimianya, ukuran partikel, dan pori-pori partikel.

Solven murni atau sistem solven tunggal dapat digunakan untuk mengelusi semua komponen. Selain itu, sistem gradient solven juga digunakan. Pada elusi gradien, polaritas sistem solven ditingkatkan secara perlahan dengan meningkatkan konsentrasi solven ke yang lebih polar. Pemilihan solven eluen tergantung pada jenis adsorben yang digunakan dan kemurnian senyawa yang dipisahkan. Solven harus mempunyai kemurnian yang tinggi. Keberadaan pengganggu seperti air, alkohol, atau asam pada solven yang kurang polar akan mengganggu aktivitas adsorben.

METODOLOGI PENELITIAN

A. Metode Penelitian

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimen kualitatif di laboratorium kimia. Penelitian pendahuluan berupa penentuan perbandingan eluen dan fasa diam yang digunakan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Kemudian ekstrak buah merah dipisahkan dengan menggunakan kolom kromatografi. Kolom kromatografi dan plat KLT yang digunakan telah dimodifikasi fasa diamnya yaitu dengan menambahkan alumina dan mangan dioksida (MnO2) kedalam silika gel. Eluen yang digunakan adalah campuran petroleum eter – dietil eter.

Hasil pemisahan diidentifikasi dengan spektroskopi infra merah(IR), spektroskopi 1H-NMR dan Gas Chromatography – Mass Spectroscopy (GC-MS).

ALAT DAN BAHAN YANG DIGUNAKAN

1.       Alat

 Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

a.       GC-MS QP2010S Shimadzu

b.      1H-NMR JEOL-MY60

c.       IR Shimadzu FTIR Prestige 21

d.      TLC Plate Coater

e.       TLC Chamber

f.       Kolom Kromatografi Tekan

g.      Lampu UV 254 nm

h.      Peralatan Gelas

2.      Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

a.       Ekstrak buah merah produksi I Made Budi

b.      Silica Gel 60 GF254 for TLC (E.Merck)

c.       Aluminiumoxid 150 basisch (Typ T)

d.      (alumina untuk KLT) (E.Merck)

e.       Silica Gel 60 (0.063 – 0.200 mm) (E.Merck)

f.       Aluminiumoxid 60 active basisch (aktivitatsstufe I)

g.      (alumina untuk kromatografi kolom) (E.Merck)

h.      Plat TLC Silica Gel 60 F254 (E.Merck)

i.        MnO2 (E.Merck)

j.        Dietil eter p.a. (E.Merck)

k.      Petroleum eter p.a. (E.Merck)

l.        Rhodamin B

m.    Aquades

PROSEDUR PENELITIAN

1.      Penentuan Eluen dan Fasa Diam denganKLT

Sejumlah adsorben yang akan digunakan untuk pelapis dibuat bubur dengan sejumlah pelarut. Adsorben yang digunakan sebagai fasa diam adalah silika gel yang ditambahkan dengan alumina dengan perbandingan silika gel – alumina sebesar 2:3 serta dengan penambahan MnO2 masing-masing sebanyak 3% dan 5% dari berat total fasa diam. Terlebih dulu silika gel diaktivasi dengan pemanasan pada suhu 110 – 125 oC sedangkan alumina diaktivasi pada suhu 125 – 150 oC selama beberapa jam.

Campuran fasa diam kemudian dibuat bubur dengan menggunakan aquades dan diratakan pada plat kaca dengan menggunakan alat TLC Plate Coater. Setelah adsorben pada plat kaca rata, plat lapis tipis yang terbentuk didiamkan selama 30 menit dan dikeringkan dalam oven pada suhu 100 – 120 oC selama 1 jam. Plat yang telah kering didinginkan dan disimpan dalam desikator.

Ekstrak buah merah ditotolkan pada plat KLT modifikasi (silika gel : alumina, 2 :3, dan MnO2) yang telah dibuat. Sebagai pembandingnya, ekstrak buah merah juga ditotolkan pada plat TLC silica gel 60 F254 dan plat KLT dengan fasa diam silika gel:alumina (2:3). Masing-masing plat kemudian dielusikan dengan menggunakan larutan pengembang berupa petroleum eter:dietil eter dengan perbandingan 7:3, 3:2, dan 1:1. Untuk mengidentifikasi adanya spot lipida pada plat modifikasi, plat yang telah dielusi dikeringkan, kemudian disemprot dengan 0,5% rhodamin B dalam etanol dan diletakkan dibawah sinar UV. Spot yang akan tampak adalah spot berwarna kuning atau berwarna ungu kebiruan ketika dilihat dibawah sinar UV.

2.      Pembuatan Kolom Kromatografi

Fasa diam yang digunakan sebagai adsorben dalam kolom adalah silika gel yang dimodifikasi dengan penambahan alumina (silika gel : alumina, 2:3) dan MnO2 3%. Sebelumnya silika gel diaktivasi dengan pemanasan pada suhu 110 – 125 oC sedangkan alumina diaktivasi pada suhu 125 – 150 oC selama 24 jam.

Campuran adsorben dimasukkan kedalam kolom dalam keadaan kering, dimana sebelumnya kolom telah diisi dengan pelarut petroleum eter hingga mencapai setengah panjang kolom. Campuran adsorben dimasukkan ke dalam kolom tiap 3 gram untuk menghasilkan lapisan-lapisan fasa diam. Keran pada kolom dibiarkan terbuka agar pelarut dapat keluar. Kemudian kolom dikeringkan dari pelarut hingga mencapai 1 cm batas atas permukaan fasa diam.

3.      Pemisahan dengan Kolom Kromatografi

Sampel berupa ekstrak buah merah dimasukkan kedalam kolom dan dibiarkan terserap kedalam fasa diam. Teknik elusi yang digunakan adalah teknik elusi gradien menggunakan petroleum eter:dietil eter dengan perbandingan eluen dimulai dari 7:3, 3:2 dan 1:1. Eluat yang dihasilkan kemudian ditampung dalam vial-vial tiap 2 mL dan dikeringkan dari pelarutnya.

Eluat yang telah kering dari pelarut atau eluen kemudian ditimbang dan diuji dengan KLT. Nilai Rf yang dihasilkan dibandingkan dengan nilai Rf dari plat KLT silika gel awal. Nilai Rf yang sama dikumpulkan kemudian fraksi yang dihasilkan diidentifikasi dengan menggunakan IR, 1H-NMR dan GC-MS.

Pemisahan Dengan Kolom Kromatografi

Kolom kromatografi yang digunakan adalah kolom yang telah dimodifikasi dengan menggunakan fasa diam silika gel - alumina (2:3) ditambahkan dengan MnO2 3%. Kolom modifikasi ini dibuat dengan metode kering yaitu dengan memasukkan campuran fasa diam kedalam kolom yang telah berisi pelarut. Campuran tersebut tidak dibuburkan terlebih dulu, tetapi langsung dimasukkan dalam keadaan kering. Penggunaan metode kering dikarenakan ukuran dari partikel MnO2 yang lebih kecil dibandingkan dengan silika gel dan alumina mengakibatkan MnO2 selalu berada diatas sehingga tidak dapat bercampur sempurna (homogen). Selain itu, berat dari MnO2 lebih ringan dibandingkan dengan silika gel dan alumina sehingga bila fasa diam dimasukkan kedalam kolom, MnO2 akan selalu tertinggal paling atas.

Gambar 7. Modifikasi Kolom Kromatografi

Kondisi fasa diam yang sulit untuk bercampur (homogen) mengharuskan untuk menggunakan suatu teknik yang dapat membuat fasa diam hampir mendekati homogen seperti pada plat modifikasi KLT. Teknik yang digunakan adalah memasukkan campuran fasa diam sedikit demi sedikit. Fasa diam yang akan terbentuk adalah fasa diam yang membentuk lapisan-lapisan seperti pada gambar 7. Dengan teknik ini, fasa diam yang dihasilkan hampir mendekati homogen sama seperti pada KLT modifikasi. Data-data mengenai kolom kromatografi modifikasi yang dihasilkan dapat dilihat pada lampiran 1.

Eluen yang digunakan adalah petroleum eter dan dietil eter dengan perbandingan 7:3, 3:2, dan 1:1. Teknik elusi yang digunakan adalah teknik elusi gradien yaitu dimulai dari perbandingan petroleum eter:dietil eter sebesar 7:3. Kolom yang digunakan disini adalah kromatografi kolom tekan, sehingga kecepatan alir dari eluen dapat diatur. Dalam pemisahan dengan kolom modifikasi ini, kecepatan alir yang digunakan sekecil mungkin yang artinya bahwa elusi yang terjadi berjalan lambat. Hal ini bertujuan untuk memaksimalkan pemisahan dan reaksi yang terjadi antara fasa diam kolom modifikasi dengan sampel. Ketika menggunakan kecepatan alir yang kecil, tekanan didalam semakin besar, sehingga pemisahan yang terjadi menjadi lebih baik.

Ekstrak buah merah diletakkan didalam kolom dan dibiarkan terjerap kedalam fasa diam terlebih dulu sebelum dilakukan elusi. Pada saat pengelusian yang terjadi adalah fraksi berwarna merah terpisah lebih dulu yang merupakan campuran trigliserida, asam lemak dengan beta-karoten. Setelah elusi berlangsung lebih lama, warna merah dari beta-karoten kemudian sedikit demi sedikit menjadi pudar. Ini menandakan bahwa beta-karoten sudah mulai bereaksi dengan fasa diam. Kemudian terbentuk pemisahan berwarna kuning setelahnya dan lama-kelamaan warna-warna dari pemisahan-pemisahan tersebut menjadi hilang secara keseluruhan.

Tabel 7.Fraksi yang Dihasilkan dari Modifikasi Kolom Kromatografi

Fraksi	Vial Eluat	Warna	Nilai Rf	Berat Fraksi
1	1 – 5	Kuning muda bening	0,87 – 0,94	294 mg
2	5 – 21	Tak berwarna	Tidak tampak noda	-
3	22 – 44	Kuning tua	0,57 – 0,68	256 mg
4	45 – 52	Tak berwarna	Tidak tampak noda	-

Identifikasi Senyawa

Fraksi pertama dari kolom kromatografi modifikasi diidentifikasi dengan menggunakan IR. Hal ini dilakukan untuk mengetahui atau menetapkan jenis ikatan (gugus fungsi) yang ada dalam molekul. Fraksi diuji dalam keadaan „neat‟, yaitu dalam keadaan cair tanpa pelarut. Spektra yang dihasilkan dari analisis IR dapat dilihat pada gambar 10.

Spektra IR dari fraksi pertama menunjukkan serapan dari uluran C-H pada alkana terletak pada 3000 – 2840 cm-1. Pada daerah 2924,09 cm-1 merupakan serapan yang dihasilkan dari uluran tak simetris dari gugus metilena (-CH2-) pada alkana. Sedangkan pada daerah serapan 2854,65 cm-1 merupakan serapan uluran simetris dari gugus metilena (-CH2-). Serapan pada daerah 725,23 cm-1adalah pita serapan yang dihasilkan dari gugus metilena untuk alkana rantai lurus yang terdiri dari tujuh atom karbon atau lebih. Pada serapan 1458,18 cm-1 menunjukkan adanya serapan getaran tekuk tak simetris dari metil (-CH3) sedangkan untuk getaran tekuk simetris berada pada daerah 1373,32 cm-1.

Spektra IR juga menunjukkan adanya pita serapan uluran gugus karbonil (C=O) yang kuat dan tajam pada daerah 1743,65 cm-1. Daerah getaran uluran C-O ditunjukkan pada daerah 1234,44 dan 1165,00 cm-1 dengan serapan yang tajam dan kuat ada pada daerah 1165,00 cm-1. Serapan uluran –C-C(=O)-O- ester tersebut dibentuk dari asam-asam tak jenuh. Serapan pada daerah 1658,78 cm-1 menunjukkan serapan dari alkena berbentuk cis. Fraksi pertama selanjutnya diidentifikasi dengan menggunakan 1H-NMR dengan frekuensi 60 MHz. Pelarut yang digunakan adalah CDCl3. Identifikasi ini dilakukan untuk mengetahui pergeseran proton pada senyawa yang ada dalam fraksi pertama. Fraksi pertama kemudian diidentifikasi dengan menggunakan GC-MS dengan kondisi yang tertera dalam lampiran2. Tujuannya adalah untuk mengetahui senyawa-senyawa yang terkandung dalam fraksi pertama hasil kolom kromatografi modifikasi. Untuk dapat dideteksi dengan menggunakan GC-MS, fraksi pertama perlu dilakukan perlakuan pendahuluan berupa reaksi transesterifikasi. Hal ini dikarenakan titik didih dari fraksi pertama yang merupakan senyawa trigliserida melebihi kapasitas dari alat yaitu melebihi suhu 300 oC. Data GC-MS menunjukkan bahwa senyawa yang dihasilkan berupa metil asam lemak yang merupakan hasil transesterifikasi. Dilihat dari prosentase asam lemak, asam lemak yang terbanyak adalah asam oleat. Senyawa lain yang terdeteksi adalah senyawa baru dengan prosentase sebesar 3,83% yaitu dioktil phtalat. Senyawa ini terdeteksi pada GC-MS berada paling akhir dengan titik didih yang cukup tinggi dibandingkan dengan senyawa lainnya.

Berdasarkan data-data yang dihasilkan dari identifikasi menggunakan IR, 1H-NMR dan GC-MS dapat diambil suatu kesimpulan bahwa senyawa dalam fraksi pertama merupakan suatu trigliserida. Dari data spektra serapan IR, menunjukkan adanya gugus-gugus fungsi yang terdapat dalam senyawa ester (RCOOR) yaitu terdiri dari serapan gugus karbonil (-CO-) dan gugus (-C-O-). Rantai R yang terikat pada gugus -COO- ini adalah berupa rantai lurus alkana yang mempunyai 7 atom karbon atau lebih dan juga terdapat ikatan rangkap berbentuk cis pada salah satu ikatan alkana tersebut. Sedangkan dari data yang ditunjukkan pada spektrum dari 1H-NMR mengindikasikan bahwa fraksi pertama merupakan suatu trigliserida. Dibuktikan dengan adanya gugus gliserida (CHx-OR), ikatan rangkap asam lemak (HC=CH) dan proton pada C-α (CHx-C=O). Identifikasi dengan GC-MS menunjukkan senyawa yang dihasilkan adalah suatu asam lemak yang merupakan penyusun dari rantai ester trigliserida.

Hasil dari identifikasi senyawa dengan menggunakan GC-MS bila dibandingkan dengan senyawa asam lemak yang ada dalam ekstrak buah merah akan memiliki prosentase kandungan yang cukup signifikan. Namun dalam hal ini yang terdeteksi dalam fraksi pertama hanya sebagian dari senyawa asam lemak yang terdapat dalam esktrak buah merah. Asam lemak tersebut adalah asam lemak yang berada dalam bentuk trigliserida, sedangkan asam lemak yang tidak terdeteksi pada GC-MS merupakan asam lemak bebas yang ada dalam fraksi kedua hasil pemisahan dengan kolom kromatografi.

Kesimpulan

Dari hasil penelitian dan pembahasan sebelumnya dapat diambil kesimpulan bahwa senyawa trigliserida dapat dipisahkan dari senyawa-senyawa lain yang ada dalam ekstrak buah merah menggunakan modifikasi teknik kromatografi kolom yaitu dengan menambahkan alumina dan agen pengoksidasi berupa MnO2 kedalam silika gel. Senyawa antioksidan dalam ekstrak buah merah akan melindungi trigliserida agar tidak rusak atau teroksidasi selama proses elusi berlangsung menggunakan modifikasi fasa diam tersebut